مقاله سرم

-1. مقدمه:

در اوایل سرم های درمانی که توسط پادزهر اسب تهیه می شد به صورت خام به مصرف می رسید. بدین ترتیب که پس از تزریق دزهای معینی از زهر به بدن حیوان و اندازه گیری میزان پادزهر تولید شده، عمل خون گیری از اسب انجام می گرفت.

سپس خونهای گرفته شده در استوانه های شیشه ای که داخل سرپوش فلزی آنها وزنه سربی آویزان شده بود، قرار می‌گرفت.

چند ساعت پس از خونگیری وزنه سربی به آ‎رامی رها می گردید و خونابه به تدریج در مدت یک تا دو روز جدا می شد و این وزنه با فشار روی لخته مقدار بیشتری سرم را جدا می کرد، سپس سرم شفاف و عاری از گویچه ها را به کمک سیفون خارج کرده و با افزودن مقداری فنل محلول در اتر، سرم را برای چند ماه تا یک سال در سردخانه رها می کردند. در این مدت مقدار زیادی آلبومین و پروتئین های غیر اختصاصی رسوب می‌کرد و پس از حذف رسوبات، سرم شفاف را پس از تعیین عیار به حجم های حدودی 500 تا 1000 واحد بین المللی تقسیم نموده و پس از تأیید با آزمایش های لازم سترونی و بی ضرری و حسن اثر، محصول نهایی آماده عرضه و مصرف پزشکی می‌گردید.

چنین سرمی طبعاً دارای آلبومین ها و پروتئین های غیر اختصاصی سرم اسب بود و ناگزیر بدن بیمار پس از تزریق نسبت به تمامی پروتئین های موجود در سرم اسب حساس می شد و استفاده از سرم اسبی برای بار دوم معمولا با عوارض و آلرژی توأم بود. از این رو در دهه های قبل از جنگ جهانی دوم مسئله تصفیه سرم و تخلیص آن بسیار مورد توجه بود. روش های متعددی برای تصفیه سرم به کار گرفته شده بود که در زیر به پاره ای از آن ها به طور اختصار اشاره می شود.

در سال 1903 در انگلستان ایمری[1] مسئله تصفیه سرم با آنزیم ها را مطرح کرد ولی از کار او استقبال زیادی نشد. چرا که به ازای از بین رفتن پروتئین های غیر اختصاصی پاره‌ای از پروتئین های اختصاصی هم از بین میر فت. در سال های 1939-1936 پارفنچف[2] دانشمند لهستانی بررسی های جالبی در ضمیمه تصفیه سرم به کمک پپسین و سولفاتها در آمریکا به ثبت رساند.

در سال 1954 در انگلستان ککویک[3] و همکاران آنها از اتر به عنوان رسوب دهنده پروتئین ها استفاده نمودند.

بنزهاف[4] نیز روشی را ارائه کرد که با دناتوراسیون حرارتی و Salting out کار تصفیه صورت می گرفت.

سیستم سولفات سدیم هاوو[5] که با افزایش تدریجی غلظت سولفات سدیم در پلاسما بود نیز یکی از روش  های تصفیه بود.

سیستم سولفات آمونیوم وودورث[6] هم تا قبل از سیستم تصفیه با اتانل سرد یکی از کارآمدترین روش های تصفیه سرم درمانی بود.

بعدها کوهن روش اتانل سرد را ابداع کرد که جامع ترین روش در آمریکا بود، در این روش با تغییر غلظت الکل اتیلیک در سرما پروتئین های پلاسما به پنج جزء اصلی تقسیم می شدند. مزیت استفاده از این روش این بود که به آسانی می توانستند موقع (خشک کردن گلوبولینها با تبخیر آزاد کرده و برطرف شوند) و عیب این روش هم این بود که تمامی این مراحل باید در سرما انجام شود. و عده ای از پروتئین های پلاسما پس از تماس دائم با الکل خاصیت ابتدایی خود را از دست می دهند و بی ثمر می‌شوند.

3-2. تصفیه و تخلیص سرم های درمانی:

از میان تکنیک های متعدد تصفیه و و تخلیص پروتئین ها، روش های رسوبی متداولترین و با سابقه ترین روش‌های جداسازی پروتئین های پلاسما محسوب می شوند که در مقیاس وسیع جهت تولید فرآورده های بیولوژیک مانند سرم های درمانی کاربرد داشته اند.

در جداسازی پروتئین های پلاسما با تکنیک های رسوبی میزان حلالیت دارای اهمیت می باشد که به خصوصیات حلال و سایر اجزا مخلوط پلاسما مربوط است.

مهمترین عوامل موثر بر  حلالیت پروتئین ها عبارتند از: PH ، قدرت یونی، دما و ثابت دی الکتریک

3-2-1. رسوب دادن با تغییر PH:

   یکی از ساده ترین روش های جداسازی پروتئین ها به طریقه تنظیم PH محلول در نقطه ایزوالکتریک[7] پروتئین مورد نظر برای ایجاد رسوب می باشد.

ولی از این روش برای خارج کردن پروتئین های نامطلوب از مخلوط استفاده می شود. و برای رسوب دادن پروتئین های مورد نیاز به دلیل احتمال دناتوره شدن آنها کاربرد ندارد.

3-2-2. رسوب دادن توسط کاهش قدرت یونی:

برخی از پروتئین ها را می توان با کاهش قدرت یونی رسوب داد ولی از آنجا که برای این کار باید به محلول پروتئین ها آب اضافه شود، لذا با کاهش غلظت پروتئین های محلول، افزایش حلالیت آنها دور از انتظار نیست. از این رو این روش اغلب در مراحل پایانی خالص سازی، که غلظت پروتئین ها در محلول به قدر کافی افزایش یافته، استفاده می شود.

3-2-3. رسوب دادن با افزایش قدرت یونی:

پدیده Salting out شالوده تعدادی از تکنیک های مهم جداسازی و تخلیص پروتئین هاست که با ایجاد غلظت بالایی از نمک خنثی در محلول پروتئینی و رسوب دادن بخشی از پروتئین ها موجب تفکیک و خالص سازی و تغلیظ آنها می گردد و از رایج ترین روش های جداسازی به طریقه رسوبگیری به شمار می رود.

مطالعه پدیده Salting out پروتئین های سرم به کمک آنالیز و سانتریفوژ نشاندهنده تاثیر پیچیده نمک روی پروتئین ها است.

مشخص شده است که بین حلالیت نمک و تاثیر آن در رسوب پروتئین ها رابطه مستقیم وجود دارد. این ایده مبنای نظریه دبای[8] در توجیه پدیده مذکور می باشد که به بیان ساده می گوید:

یون های نمک اکثر ملکول های قطبی محیط (حلال) را به طرف خود جذب کرده و اطراف مولکول های پروتئین از آنها خالی می گردد و متعاقباً بدنبال برخورد های تصادفی مولکول های پروتئین با یکدیگر تجمع مولکولی ایجاد و رسوب تشکیل می‌شود.

هرگاه نمک به محیط اضافه شود مولکول های حلال قطبی از اطراف پروتئین به طرف یون های نمک جذب می شود و مولکول های پروتئین به طور تصادفی در مجاورت یکدیگر قرار می گیرند، در حالی که لایه آب به شکل موثر وجود ندارد تا مانع جذب آنها به یکدیگر شود، در نتیجه تجمع یافته و تشکیل رسوب می دهند.

    پروتئین های بزرگتر که سطح بیشتری دارند (مولکول هایی با گروههای غیر قطبی) با مقادیر نمک کمتری رسوب می کنند و مولکول های کوچکتر که گروههای غیر قطبی کمتری دارند در غلظت های زیادتر نمک رسوب می نمایند.

به دنبال بررسی های کمی پدیده Salting out رابطه ای خطی بین لگاریتم حلالیت یک پروتئین معین و قدرت یونی محلول در قالب معادله خط بیان می گردد:

در رابطه فوق:

S= حلالیت پروتئین                        = عرض از مبداء

= قدرت یونی محلول                  =  شیب خط یا Salting out constant

 برای یک پروتئین و نمک معین، مستقل از دما و PH است ولی  به طور مشخص، تحت تاثیر هر دو عامل یاد شده قرار دارد.

در روش های مبتنی بر Salting out معمولا جداسازی یک پروتئین معین به صورت رسوب در PH نزدیک نقطه ایزوالکتریک آن پروتئین بیشترین بازده را دارد. همچنین ممکن است در غلظت بالای نمک پروتئین ها در بیش از یک PH حداقل حلالیت را نشان دهند که می تواند به دلیل تشکیل نمک های نامحلول پروتئین در آن  PH خاص باشد.

میزان تاثیر نمک در پدیده مورد بحث به طبیعت آنیون و کاتیون ، حاصل از تفکیک یونی نمک خصوصاً به آنیون آن مربوط می شود. موثرترین آنیون ها، آنیون های چند ظرفیتی و موثرترین کاتیونها، انواع یک ظرفیتی آنها می باشند. میزان کارآیی آنیون ها و کاتیون ها به صورت زیر است:

آنیون ها :  

کاتیون ها : 

نمک های خنثی که در این تکنیک ها مصرف می شود باید حتی المقدور خالص بوده و از حلالیت بالایی برخوردار باشند، به هنگام حل شدن تغییر قابل ملاحظه ای در PH و دمای محلول ایجاد نکنند و ارزان باشند. نکته آخر اینکه چگالی محلول پس از افزودن نمک به نحوی تغییر نیابد که سانتریفیوژ را با مشکل مواجه نماید. از میان انواع نمک هایی که مصرف آنها متداول است سولفات آمونیوم  به دلیل ارزانی و حلالیت مناسب بیش از سایر نمک ها به کار گرفته شده است.

چگالی محلول اشباع آن در حدود 23/1 است که ممکن است در عمل پس از اضافه کردن به محلول پروتئینی چگالی آن را افزایش دهد و سانتریفیوژ را با مشکل مواجه نماید و همچنین اندکی محلول را اسیدی می‌کند که در صورت لزوم می توان از بافر مناسب استفاده کرد.

غلظت سولفات آمونیوم معمولا به صورت درصد اشباع (درصد  محلول اشباع سولفات آمونیوم) بیان می شود. مقدار نمک سولفات آمونیوم لازم برای دست یابی به دذثئ اشباع مطلوب در یک لیتر محلول و در دمای 20 به صورت معادله زیر محاسبه می شود.