آماده سازی محیط کشت
3-1 ترکیبات محیط کشت
بطور آشکار محیط کشت غذایی عامل مهم در کشت بافت و سلول بشمار می آید، البته برای هر کدام از گونه های درختی آزمایش های فاکتوریل که در آنها کلیه مواد شیمیایی محیط کشت در طیف وسیعی از غلظت های متغیر باشند، انجام نگرفته است. برای انجام چنین تحقیقی به امکاناتی بیش از آنچه که در اکثر آزمایشگاهها موجود است نیاز می باشد.
آنچه که طراحی محیط کشت را بطور خاصی مشکل می کند، اثرات متقابل بسیار پیچیده مواد شیمیایی مختلف در یک محیط کشت غذایی مشخص می باشد. بعنوان مثال کاربرد بعضی از قندها ر محیط کشت سبب کمبود بر می شود. پیچیده تر از آن ا حالتی است که بر بیش از حد نیاز وجود داشته باشد در این حالت نیاز بافت به کلسیم کاهش خواهد یافت. به دلیل وجود چنی اثر متقابلی، تعیین ترکیبات مطلوب محیط کشت از طریق آزمایشهای فاکتوریل مشکل است. از طرفی این وضعیت با درنظر گرفتن این حقیقت که اثرات متقابل بین بافت و مواد غذایی تحت تأثیر شرایط محیطی از قبیل شدت و کیفیت نور، دوره نوری، درجه حرارت، آگار یا مایع بودن محیط کشت، PH، و غیره قرار می گیرند پیچید تر می گردد. بعلاوه عکس العمل بافت با تغیر وضعیت فیزیولوژیکی ریز نمونه با بافتی که واکشت شده فرق می کند.
محیط کشت های اولیه که در کشت بافت بکار می رود محلول های غذایی تغییر یافته کشت آبکشت گیاهان بود( محلول های غذایی ناپ، ففر و هوگلند- جورج و شرینتگتن) به این مواد مخلوطی از اسیدهای آمینه، ویتامینها و سایر ترکیبات آلی اضافه می شد. امروزه اکثر کشتهایی که استفاده می شوند نوع تغییر یافته محیط های قدیمی هستند با بررسی فهرستی مشتمل بر 260 محیط کشت بافت گیاهی تنها 39 محیط کشت دارای ترکیبات پایه بودند محیط کشت موراشی و اسکوک (MS )[1]بین سایر محیط کشت های گیاهی بیشترین کاربرد را دارد. از میان محیط کشت های ذکر شده توسط جرج و شرینتگتن، 53 محیط کشت از نظر فرمول عناصر پرمصرف مشابه محیط کشت MS بودند ولی در قسمت های دیگر تفاوت داشتند.
اکثر محیط کشت ها از طریق آزمون و خطا بتدریج بهبود یافته اند. البته در برخی از محیط کشت ها روش تجربی کمتر بکار رفته است. مقدار مواد معدنی موجود د محیط کشت MS براساس تجزیه خاکستر بافت توتون سوزانده شده می باشد. محیط کشت LM که اغلب برای سونی برگها استفاده می شود براساس تجزیه ترکیب شیمیایی آرکگونهای بذر نابالغ Pseudostsuha menziesii است البته هیچ گونه تضمینی وجود ندارد که این محیط کشت ها برای تمام ژئوتیپ ها مطلوب باشند یا اینکه چنین تجزیه شیمیایی برای تمام انواع بافتهای گونه های مختلف انجام شده باشد. محیط کشت موردنیاز جهت رشد کالوس نسبت به محیط کشت برای ایجاد و رشد ساقه بایستی دارای مواد معدنی با غلظت بیشتری باشد در حالیکه محیط کشت موردنیاز جهت ایجاد و رشد ریشه فرق می کند محیط کشتی که برای کشت پروتوپلاست بکار می رود اغلب با محیط کشتی که برای پروتوپلاست استفاده می شود بطور کامل تفاوت دارد. از طرف دیگر گونه هایی وجود دارد که درطیف وسیعی از محیط کشت های بخوبی رشد می کنند؛ یعنی محیط کشتهای مطلوب و مشخصی برای اینها وجود ندارد. همچنین حالت هایی و جود دارند که در آنها تهیه یک ژئوتیپ مناسب از تهیه یک محیط کشت مطلوب و دقیق مهمتر است. چنین حالتی برای جنس Populus وجود دارد. بعضی از ژئوتیپهای این جنس روی محیطهای آزمایش شده خیلی ضعیف رشد می کنند در برخی از گونه ها هر رقم دارای نیازهای غذایی مخصوص به خود است.
جرج و همکاران براساس مواد تشکیل دهنده، محیط کشت بافتهای گیاهی را به چهار دسته عمده، عناصر پرمصرف، عناصر کم مصرف، ویتامینها و اسیدهای آمینه یا آمیدها تقسیم کرده اند. برخی از محیط کشت ها مانند وایت، موراشی واسکوگ، گامبور و همکاران(B5 ) لیتوی و لوید و مک کاون محیط کشت های پایه[2] یا تقریباً پایه هستند. بسیاری از محیط کشتهای مورد استفاده دیگر آنهایی هستند که در اثر تغییر کلی یا جزئی محیط کشت های پایه حاصل شده اند.
عناصر پرمصرف محیط کشت موراشی و اسکوگ اغلب در حد یا غلظت محیط پایه رقیق می شوند به همین ترتیب چنین کاری در سایر محیط کشت ها که غلظت عناصر در آنها بالاست انجام می گیرد.
علاوه بر طبقه بندی محیط کشتهای ذکرشده در بالا محیط کشتها را می توان به دو حالت مایع و جامد نیز تقسیم کرد. در حالت جامد محیط دارای عامل ژله کننده است که بافت کشت شده را روی سطح محیط نگه می دارد. این محیط کشتها همچنین درای ویتامینها، اسیدهای آمینه، تنظیم کننده های رشد کربوهیدراتها و اغلب سایز مواد تشکیل دهنده موردنیاز نیز هست.
3-1-1 عوامل تولیدکننده ژل و جایگزینی آنها
3-1-1-1 آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل
آگار از رایجترین عامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده می شود. آگار پلی ساکاریید هایی پیچیده است که از برخی گونه های نوعی علف هرز دریایی بدست می آید آگار طی مراحل ساخت در جات متفاوتی از خلوص را طی میکند. ولی مقداری ناخالصیهای آلی و معدنی در آن باقی می ماند. دیفکوباکتوآگار از رایجترین آگار مصرفی در کشت بافت است که دارای مقدار زیادی سدیم و مس می باشد. میزان سدیمی که از طریق آگار در محیط کشت وارد می شود براحتی توسط بافت اکثر گیاهان تحمل می شود. اما گاهی اوقات مس در محیط کشت ایجاد سمیت می کند. محققان اغلب آگار را در غلظت های بین 5/0 و 1 درصد بکار می برند غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در بافت می شود و غلظت های کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریزنمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر می شود. بعلاوه کشت ریزنمونه روی محیط کشت مایع می تواند باعث شیشه ای شدن[3] کشتها شود علیرغم آنچه بیان شد بعضی از کتشها روی محیط با غلظت کم آگار رشد بهتری دارند. بعنوان مثال ماده خشک در نوک شاخه های Picea obies در حیط کشت با غلظت آگار 125/0 % نسبت به غلظت 1% سریع تر تجمع می یابد. این ممانعت در غلظت بالای آگار احتمالاً مربوط به تجمع سریع فرآورده های زاید( اینورتاز) در سطح زیرین نمونه است و در میحط با غلظت کم آگار ممکن است به دلیل اینکه میزان انتشار مواد به اندازه کافی وجود داشته از بروز چنین حالتی جلوگیری شده باشد. انواع متداول آگار در دمای بیش از 40 در جه سانتیگرا تشکیل ژل می دهند. میزان سختی ژل به PH محیط کشت بستگی دارد. از محیط کشت های تغییر یافته رینرت و ایت با 5/0 آگار برای کشت بافتهای شیمر Picea glouca استفاده شده است. در PH 5/5 محیط کشت کاملاً سفت بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت، محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تر تشکیل ژل می دهد . محیط کشت بسیار نرم بود، در صورتی که در PH های 4 یا 5/4 برای نگهداری بافت محیط کشت بسیار نرم بود. اخیراً کارهای خالص تری عرضه شده که در درجه حرارت پائین تشکیل ژل می دهند. از این ژل ها می توان برای تثبیت پروتوپلاستها و یا تک سلولی ها درون یک شبکه استفاده کرد ولی به دلیل قیمت بالای آنها، کاربرد آنها محدود به آزمایش های کوچک است.
تصور می شود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی می تواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روشی مشابه زغال نماید. همچنین این خاصیت می تواند مانع جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به دشت توسط آگار جذب می شود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل تر می کند. همچنین گزارش شده آگار در غشای سلولی سبب قطعیت مثبت می شود. اگرچه مدارک موجود متناقض است. تداومم موفقیت آگار در کشت بافت ممکن است مربوط به جذب پیچیده و قابلیت الکتریکی باشد؛ با این حال برخی محققان به دنبال یافتن جانشین های ارزانتر و بهتر برای آگار هستند که اثرات متقابل پیچیده کمتری با بافت کشت شده نشان می دهد.
متداولترین جایگزین آگار ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیده خارجی سلولی است که توسط Pseudomonas elodea تولید می شود. ژل رایت زمانی که در حضور کاتیونهای مختلف بخصوص منیزیم و کلسیم حرارت داده شود ژل سختی را تشکیل می دهد. استحکام ژل رایت بین PH 4 تا 7 به مقدار خیلی کم تغییر می کند. بعلاوه ژل رایت به شدت به مقابل تجزیه شدن توسط آنزیم های آزاد شده از میکروبها مقاومت می کند.( همچنین آنزیمهایی که ممکن است از سلولهای گیاهی آزاد شود.) در دمای بین 30-45 درجه سانتیگراد جامد می شود و ذوب آن در دمای بالا یا پائین تر از 100 درجه سانتیگراد بسته به شرایطی که در آن ژل تشکیل می شود انجام می گیرد. ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصیهای آلی کمتری است. البته دارای غلظت های بالای پتاسیم و منیزیم می باشد تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کششها در ژل رایت سریعتر از آگار، شیشه ای می شوند. در مطالعه ای بمنظور مقایسه اثر آگار و ژل رایت بر جنین زایی سوماتیکیPican obits انجام شد مشخص گردید که عکس العمل مشاهده شده در محیط کشت یا 3/1- 7/0 آگار مشابه محیط کشت دارای5/0-2/0 ژل رایت است البته کوتیلدون های Pinus canariensis روی محیط کشت دارای 8/0 دیفکوباکتو آگار جوانه های بیشتری نسبت به محیط کشت های که دارای غلظت های متفاوت ژل رایت بودند تشکل دادند. در محیط کشتی که توسط آگار، جامد شده باشد به مرور زمان PH کاهش می یابد اما محیط کشت دارای ژل رایت، PH نبات بیشتری دارد. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت های موردنیاز از هرکدام به کار می برند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده می شود و معایب آنها نیز کاهش می یابد.
برای جامدکردن محیط کشت از نشاسته های مختلف نظیر نشاسته جو، ذرت، سیب زمینی، و گندم نیز استفاده شده است . این نشاسته ها برخلاف سایر عوامل تولیدکننده ژل می توانند بعنوان منبع کرنبه نیز عمل کنند. بعضی از هیدراتهای کربن که از شکسته شدن آنزیمی نشاست تولید می شوند اندروژنز در بساک برخی از گونه ها را تحریک می کنند درآزمایش ساقه های Betula pendula روی محیط کشتی که با پالپ سیب، جامد شده بود کشت گردیدند ریشه زایی در این محیط بهتر از محیط کشت حاوی آگار انجام گرفت.
آلژینات کلسیم غالباً برای محفاظت از بذر مصنوعی و آگاهی برای کشت پروتوپلاست بکار می رود در صورتیکه برای تولید بذر مصنوعی استفاده شود جنینهای سوماتیکی با آلژینات سدیم مخلوط شده و سپس در محلول نمک کلسیم ترکیب می گردند. برای قراردادن سلول های گیاهی در بستر آلژینات، محیط غذایی مایع با آلژینات مخلوط و سوپانسیون سلولی با استفاده از یک سرنگ با فشار در داخل آن قرا داده می شود با استفاده از نازل میتوان این فرآیند را سرعت داد و به سطح مطلوبی برای تولید صنعتی رسانید. آلژیناتی که برای پلیت کردن پروتوپلاست استفاده می گردد نیز بطور مشابه با اضافه کردن یونهای کلسیم جامد می گردد. مزیت اصلی آلژینات این است که در حرارت اتاق می تواند جامد شود. بنابراین سلول ها یا پروتوپلاستها در هنگام قراردادن در داخل آلژینات متحمل شوک کلسیم را از آلژینات جدا کند مجدداً آن را به مایع تبدیل کرد. با این روش می توان کلنی های رشد کرده حاصل از پروتوپلاستهای تزریقی را بدون اینکه در معرض تنش گسترده ای قرار گیرند، بازیافت کرد. در صورتی که آلژینات اتوکلاو شود از بین خواهد رفت. برای ضدعفونی کردن می توان آن را به مدت 20 دقیقه در دمای 90 درجه سانتیگراد قرار داد. تک سلولیهای داخل شده در آلژینات را می توان با داخل کردن مجدد آن در پلی آکریب آمید استقرار بیشتری بخشید پلی آکریل آمید در حالت ژله ای خاصیت سمی دارد اما چسبندگی آلژینات در اطراف سلول ها، پوشش مناسبی بمنظرو حفظ سلول ها از این سمیت ایجاد می کند.
برای کشت پروتوپلاست اغلب آگاروز را بیش از آگار یا آلژینات ترجیح می دهند البته در بعضی مواثع پس از مدتی برای پروتوپلاست ایجاد سمیت می کند کشت پروتوپلاست روی آگاروز از نظر تقسیم آگاروز یا بلوک های قرراگرفته در محیط کشت مایع دارای مزایای متعددی است. کشت پروتوپلاست ها بصورت صفحه ای در جوار یکدیگر در مقادیر کم آگاروز دارای همان شرایط محیط کشت درون آگاروز خواهد بود. وجود مقادیر زیاد محیط کشت مایع در اطراف آگارروز، مواد غذایی ، ضروری را برای آگاروز بطور مداوم فراهم می کند و فرآورده های زیاد تولیدشده توسط پروتوپلاستها با سلولها را دفع می کند. افزون بر این می توان براحتی محیط کشت مایع جدید یا محیطی کشتی را که از نظر ترکیبات شیمیایی تغییر یافته یا حداقل اختلال جایگزین محیط کشت قدیمی نمود. آگاروز درد مقایسه با آگار در دمای کمتری جامد می شود. بنابراین پروتوپلاست ها در زمانی که آگاروز نزدیک به جامدشدن است، زنده باقی خواهند ماند. کیفیت آگارزو اغلب در زنده نگهنداشتن پروتوپلاست مهم است. آگاروز د کشت سلول هایی که به آگار بسیار حساس هستند نیز بکار می رود. سلول های کاج(Callitris drummondii ) زمانی که در محیط کشت حاوی آگار با غلظت ه کمی همچون 1/0 قرار گرفتند قادر به تقسیم سلولی نبودند اما در محیط کشت که با آگاروز جامد شده بود بخوبی رشد کردند.