مواد جهش زای خاک
خلاصه
این تحقیق جهش های گامتوفیت های سرخس/ هاپلوئید جمع آوری شده از طبیعت را به منظور آزمایش وجود مواد جهش زا در محیط طبیعی بررسی می کند. گامتوفیت های سرخس O.Sensibilis حاصل از اسپورهای جمع آوری شده از 14 جمعیت طبیعی اطراف منطقه مونترال، کانادا،مورد بررسی قرار گرفتند. بیشتر جمعیتها در خاک مجاور با جریان بهای رودخانه سنت لارنس رشد کرده اند. سرعت جهشهای پیکره ای تخمین زده شده، در میان جمعیت های مختلف دارای تفاوت بود، که بیشتر این تفاوت میان جمعیت های ساکن در پایین دست مونترال (جهش بالا) و جمعیت های ساکن در بالا دست رودخانه (میزان جهش پایین) دیده شد.
1- مقدمه
تحقیقات مربوط به تاثیر آلاینده ها بر میزان زنده ماندن گیاهان و جانوران بیشتر بر جنبه های فیزیولوژی تاکید دارند. تاثیر جهش زای مواد به تازگی مورد توجه قرار گرفته است، زیرا سطح این تاثیر معمولاً بالا و عوارض آن شدید است. این تاثیرات می‌توانند موجب کاهش قابلیت زیستن جاندار در زمان های طولانی مدت از طریق ایجاد اثرات فرض شوند، و یا موجب کاهش موفقیت تولید مثلی جاندار شوند.
از جمله اثراتی که به سختی قابل تشخیص هستند، اثرات مزمن ناشی از جهش های حذف می باشند، به خصوص آن دسته که در سلولهای جنسی رخ می دهند. تجمع جهشهای حذف در خزانه ژنی یک جمعیت می تواند حتی منجر به انقراض محلی آن جمعیت از طریق کاهش مستقیم شایستگی و یا کاهش میزان آمیزش ها شود. نشان داده شده است در جمعیت های مگس سرکه با میزان جهش تقریباً یک جهش بر ژنوم بر نسل، جمعیت های کوچک در خطر انقراض به وسیله تجمع جهشها قرار دارند. همچنین اگر میزان جهش از آن چیزی که در این تحقیق در نظر گرفته شد بیشتر باشد (به عنوان مثال به دلیل وجود آلاینده های جهش زا) احتمال انقراض جمعیت به وسیله تجمع جهش ها بیشتر نیز خواهد بود.
تشخیص عوامل جهش زا در محیط های طبیعی نیازمند ابزارهایی است که قادر به تشخیص سریع و موثر جهش زایی باشد. این نیاز منجر به گسترش طیف وسیعی از آزمونهای آزمایشگاهی با استفاده از کشت سلولها و یا جانداران آزمایشگاهی به منظور تشخیص پاسخ های جهش زایی در برابر مواد طبیعی جمع آوری شده از محیط شده است. آزمون در شیشه بر روی باکتری ها، مخمر، و یا سلولهای جانوری که در مجاورت سوسپانسیون های مایع قرار گرفته اند یکی از مورد اعتمادترین و کم هزینه‌ترین روشهاست.
یکی از معمولترین آزمونهای در شیشه، آزمون میکروزوم سالمونلا یا آزمون رایم است. این تست جهش برگشت سویه های اکسوتروف نیازمند به هیستیدین در S.typhimurium به سویه های پروتونروف را در اثر مواد جهش زا بررسی می کند.
گرچه آزمون های میکروبی کوتاه مدت مانند آزمون جهش در سالمونلا روشی حساس و سریع برای تشخیص عوامل جهش زا در اختیار می گذارد، تعمیم نتایج به جمعیت های وحشی به دلایلی با مشکل مواجه است. جمعیت های وحشی گیاهان و جانوران به مدت زیادی در مجاورت با مواد جهش زا قرار می گیرند و ممکن است در غلظت های پایین تری به آن پاسخ دهند.
همچنین چون در جمعیت های وحشی، ژنها به نسل بعد منتقل می شوند، ممکن است تجمع جهشهای کشنده باعث ایجاد اثرات مخرب در نسلهای بعد شود. علاوه بر اینها، ممکن است جانداران وحشی دارای موانع فیزیکی در برابر مواد جهش زا باشند و یا با مواد زد جهش زا یا سیستم ترمیم DNA، اثر مواد جهش زا را خنثی کنند. بنابراین بررسی میزان زنده ماندن جمعیت های طبیعی در پاسخ با مواد جهش زا نیازمند آزمونهای در شیشه و همچنین بررسی اثر این مواد در خود محیط طبیعی است.
برای نخستین بار در سال 1973 از سرخس برای آشکار کردن آلاینده های جهش زا استفاده شد. سرخس دارای مزیت هایی برای آشکارسازی جهش های حاصل از مواد موجود در طبیعت است. اول این که تمام سلولهای پیکر سرخس از یک سلول مرسیستمی واحد در راس ریزوم این گیاه سرچشمه می گیرند. بنابراین جهش در این سلول به تمام سلولهای دختر شامل سلولهای مادر اسپور نیز منتقل شده، در رسپورهای حاصل از میوز نسبت یک به یک بین انواع وحشی و جهش یافته دیده می شود.
دوم اینکه رشد رسپور هاپلوئید منجر به یک مرحله گامتونیت می شود که دارای مورفولوژی مخصوص به خود است. این گامتوفیت اگرچه برای مدتی وابسته به گیاه مادر است، ولی پس از مدتی از نظر متابولیکی کاملاً مستقل می شود. بنابراین اگر به این گامتوفیت هاپلوئید یک جهش کشنده رسیده باشد، فقط قادر به تعداد کمی تقسیم سلولی پیش از اینکه از بین برود می باشد. این موضوع منجر به نسبت یک به یک بین گامتوفیت هایی که از بین می روند و گامتوفیت های طبیعی می شود.
2- روشها
- جانداران مورد مطالعه و نمونه برداری از جمعیت
Onoclea Sensibilis، سرخس حساس، به طور طبیعی در جنگلها و مناطق مرطوب شمال آمریکا و مناطق مجاور آن در کانادا یافت می شود. جمعیت ها از افرادی تشکیل شده اند که به صورت دسته جمعی از ریزومهایی که زیر سطح خاک رشد می کنند تولید می شوند. ریزومها معمولاً به هم می پیچند و به همین دلیل تشخیص و جدا کردن ژنیت های مختلف از یکدیگر به سختی انجام می شود. این گیاهان معمولاً فروندهای دو شکلی ایجاد می کنند که جنسی و یا رویشی اند.
14 جمعیت مختلف نمونه برداری شدند (جدول 1). 10 نمونه در نزدیک رودخانه سنت لارنس رشد می کردند، که 3 جمعیت مربوط به بالا دست و 7 جمعیت مربوط به پایین دست رودخانه می شدند. چهار نمونه دیگر از مناطق خارج از حوزه رودخانه جمع آوری شدند.
20 میلی لیتر محیط نمکی غیرآلی و یک درصد آگار قرار داده شدند، طوری که دانسیته در هر ظرف پتری بین 200 تا 500 اسپور باشد. بلافاصله ظرف های پتری به اتاق کشت بافت منتقل شدند و در تابش فلورسانی 120 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه در دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. تابش نور باعث تحریک رشد سرخس میشود. پس از 4 هفته، کشت گامتوفیت ها مورد بررسی قرار گرفتند.
- نمونه برداری از خاک و تست ایم بر روی خاک
یک نمونه با قطر یک سانتیمتر و عمق 10 سانتیمتر از مرکز هر یک از 11 جمعیت برداشته شد. نمونه های خاک در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. نمونه‌های خاک با سولفات سدیم ایندرید خشک شدند. اکستراکت نهایی در یک میلی لیتر از دی کلرومتان نگهداری شدند. جهش زایی سوسپانیون حاصل با روش استاندارد میکروزوم سالمونلا مورد آزمایش قرار گرفت.
از چهار سویه S.typhimurium در این مطالعه استفاده شد:
تغییر چارچوب استاندارد و سویه های جهش جفت باز TA98 و TA100 و سویه‌های YG1041 و YG1042. سویه های آخر تولید مقادیر زیادی O- استیل تر فسفراز می کنند که به همراه نیتروردوکتاز اجازه تشخیص آمین های آروماتیک را می‌دهند. بیشترین غلظت های مورد آزمایش بین 120 تا 678 میلی گرم وزن خشک بر هر پلیت بود.
3- نتایج
- تنوع در میزان گامتوفیتهای جهش یافته در مناطق مختلف
به طور کلی، حداقل یک فرد در هر جمعیت اسپورهایی تولید می کرد که منجر به گامتوفیت با مورفولوژی غیرمعمول می شد. میزان گامتوفیت های جهش یافته در جمعیت پایین دست رودخانه سنت لارنس بیشترین مقدار ممکن بود (جدول 2). اکثر گامتهای جهش یافته قادر به رشد به صورت مستقل نبودند. این مشاهده به میزان کمتری در قسمتهای بالا دست رودخانه و به مقدار بسیار کمتری در نواحی رود از رودخانه دیده شد (جدول 2).
- تخمین نسبت گیاهان دارای جهش های تک ژنی
بین جمعیت ها، تولید گامتوفیت های جهش یافته به طور غیر تصادفی با توجه به رسپوروفیت های نمونه گیری شده پراکنده بودند (شکل 4).
فرض شده است که تولید یک گامتوفیت غیرمعمول به خاطر یکی از دلایل زیر است:
1- جهشهای تک ژنی در سلول راسی که منجر به تولید بافت اسپورزای جهش یافته شده است.
2- دسته بندی اشتباه اسپورهای نابالغ و یا دیر رو به عنوان گامتوفیت های حاوی جهش.
بنابراین، احتمال اینکه کلون iام به جدا شدن یک جهش متوقف کننده اسپوروفیت بینجامد به صورت زیر محاسبه می شود:
که K یک عدد ثابت است، n1 و n2 تعداد گامتوفیت های طبیعی و غیرطبیعی در نمونه اسپور iام است و C احتمال مشاهده یک گامت غیرطبیعی به دلیل نابالغ بودن یا دیر رو بودن اسپور است.
احتمال اینکه کلون jام فاقد جهش متوقف کننده گامتوفیت باشد، به صورت زیر محاسبه می شود.
که n2,n1 تعداد گامتوفیت های طبیعی و غیرطبیعی در نمونه jام است.
- تنوع در میزان جهش های پیکره ای
تنوع در نسبت های گیاهان که منجر به جدا شدن جهشها شده اند، منجر به احتمال تنوع در میزان جهش های سوماتیک بین جمعیت ها می شود. اگر فرض کنیم جهشها طی رشد گیاهی کلون سرخس ایجاد می شوند، می توان تخمینی از میزان تنوع نسبی در جمعیتها برای میزان جهشهای سوماتیک بدست آورد، برای مثال واریاسیون در میزان جهشهای پیکره‌ای بر واحد رشد گیاهی. هر فروند جنسی فرض شده است از یک کلون جدا مشتق شده است.
فرض شده است کلون ها به یک میزان رشد کرده اند و جهش های سوماتیک نادرند. تحت چنین شرایطی، نسبت کلونهای خالی از جهش از یک توزیع پواسن پیروی می کنند. با استفاده از این روش، میزان جهشهای سوماتیک در برخی از جمعیت‌های پایین دست رودخانه 10 برابر بیش از میزان جهش در جمعیت های دیگر تخمین زده می شود.
- آزمون ایم سوسپانسیون خاک و ارتباط با نتایج آزمون سرخس
آزمون پایلوت با استفاده از سوسپانسیون خاک سرل در حضور فعال سازی متابولیکی S9 پاسخ جهش زایی مثبتی را نشان می دهد. مقایسه بین پاسخهای مشاهده شده توسط سویه های فعال از نظر متابولیکی YG1041 و YG1042 و والدهای آنها افزایش قابل ملاحظه ای در پاسخ جهش زایی در حضور OAT و NR نشان نداد. به هر حال، نتایج، پاسخ اندک ولی قابل توجه YG1041 بدون فعال سازی S9 را آشکار می سازد. نمودار غلظت- پاسخ برای 11 عصاره خاک رسم شده و پاسخ های جهش‌زایی مورد بررسی قرار گرفتند.
شکل 5 نمونه هایی از نمودارهای غلظت- پاسخ را برای TA98 و TA100 نشان می دهد. شش نمونه از 7 نمونه پایین دست، پاسخ مثبت قابل توجهی را نشان دادند. تنها نمونه باقی مانده، پاسخ متوسطی را نشان