دانلود تحقیق تکنیک‌ های تهیه و تولید کشت آگار

مقدمه

هوایی که از آن تنفس می‌کنیم مملو از موجودات بسیار ریز است که با باد به حرکت درمی‌آیند. قارچ‌ها، باکتریها، ویروسها و گیاهان برای انتقال گرده‌های خود به مناطق دیگر از باد کمک می‌گیرند. در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی، این ذرات می‌توانند چه در تهیه کشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراکی خلل وارد نمایند.

به طور کلی منابع اصلی آلاینده محیط کشت عبارتند از

1. محیط اطراف

2. ظروف کشت

3. ادوات و ابزار کشت

4. پرورش دهنده و لباس وی

5. هاگ‌ ها یا میسلیوم قارچ خوراکی

قارچ‌ ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یکدیگر دارند. هدف از ایجاد یک محیط استریل، حذف یا کاهش این گونه رقابت و در نهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تکثیر قارچ خوراکی می‌باشد. اولین مرحله قبل از تهیه کشت خالص، احداث اطاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.

طراحی و احداث آزمایشگاه استریل

علت عمده شکست بیشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. کاری که چندان هم وقت و انرژی نمی‌برد، بلکه فقط یک و نیم روز کافی است تا یک انباری کوچک یا یک آبدارخانه را به یک اطاقک تلقیح مفید تبدیل نمود.

برای شروع تمام قالیچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و دیگر مواد پارچه‌ای را که پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ‌های مضر می باشند از محل دور کرده و تمامی دیوارها و سقف را با یک ماده ضد عفونی کننده کاملاً تمیز نمائید. اطاق را با یک رنگ روغنی براق یا اپوکسی بهداشتی رنگ زده تا شستشو‌های بعدی راحت‌تر گردد. پنجره‌ها یا هر منبع ورودی هوا را با یک پوشش پلاستیکی مناسب بپوشانید. محل ورودی اطاق را با پلاستیک یا هر ماده دیگر بصورت یک محفظه انتظار درآورده تا مانع جریان مستقیم هوا بدرون اطاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه‌ای باشد که هنگام ورود به آن؛ درب آزمایشگاه بسته باشد.

تجهیزات ذیل در هر آزمایشگاه ضروری است:

1- صندلی و میز محکم با سطح کاملاً صاف

2- چراغ الکلی، چراغ بنسن[1] یا یک شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت

3- بطری اسپری حاوی محلول سفید کننده 10 درصد

4- تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش

5- تعدادی برچسب ، یک دفتر و خودکار

6- یک چاقوی آگار و حلقه تلقیح[2]

7- یک دستگاه اتوکلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار)

8- pH  سنج یا کاغذ تورنسل معمولی

9- الکل 96 درصد و دیگر مواد ضد عفونی همچون وایتکس، فرمالین…

10- قفسه برای ظروف کشت، جالوله‌ای و…

تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یکی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.

به طور کلی برای طراحی یک آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز درنظر گرفته شود.

—   اطاق تهیه محیط کشت که دارای تجهیزات کامل و قفسه‌های متعدد است (35 درصد مساحت کل)

—   اطاقک شیشه‌ای استریل (محفظه تلقیح)(15 درصد مساحت کل)

—   اتاق کشت (40 درصد مساحت کل)

با روش ساده‌ای می‌توان آزمایشگاه یا محیطی نیمه استریل بسته به حجم استفاده و دفعات کاری ایجاد نمود. درصد پاکی لازم برای اطاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده‌های هوا تا حد زیادی کاهش یافته، حال آن که در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می‌باشد. بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه کافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نکته مهم دیگر این که، تمامی ظروف و بطری‌های شیشه‌ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد.

بعد از احداث اطاق استریل باید یک سری اصول و نکات بهداشتی را کاملاً رعایت نمود. به این صورت که اطاق استریل را باید با یک محلول سفیدکننده (آب ژاول) کاملاً تمیز نمود؛ کف را طی کشیده و در پایان هوای اطاق را با یک محلول سفید کننده 10 درصد و با استفاده از یک سمپاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی نمائیم. حداقل تا 15 دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقیح و کشت این عملیات باید تکرار شود، چرا که همواره پیشگیری آسانتر و بهتر از درمان است.

پیش از ادامه بحث، ذکر چند نکته ضروری است. استریل نمودن و استریل نگاه داشتن محیط مستلزم توجه زیاد همراه با کمک و یاری مداوم دیگران است. این امر وقت‌گیر بوده و نباید سرسری و مقطعی انجام گیرد. هرگز یک چراغ الکلی یا شعله گاز را درون اطاق یا محفظه تلقیح روشن نگذارید، چرا که در یک محیط بسته اکسیژن هوا به زودی تمام می‌شود.

بعضی از پرورش‌دهندگان، بیش از نیاز لازم بهداشتی با آلودگی مقابله می‌نمایند. بدین ترتیب این افراد آزمایشگاه و در نهایت سلامتی خود را با مصرف وسواسی و افراطی قارچ‌کشها، باکتری‌کشها و ضدعفونی کننده‌های شیمیائی جهش‌زای خطرناک به خطر می‌اندازند. به طور مثال می‌توان به عوارضی همچون تنگی نفس، بی‌حسی‌های شدید همراه با تشنج‌های مداوم که گاه تا چندین روز نیز به درازا می‌انجامد که بر اثر کار طولانی مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائی که مدت چندانی (کمتر از 15 دقیقه) از سمپاشی آنها بالاخص با سموم فنلی نگذشته اشاره کرد و یا از بین موارد متعدد دیگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولانی (چند سال) و مستقیم پوست (بدون پوشش ایمنی) با اشعه ماورای بنفش (uv) در حین استریل کردن نمونه‌ها داخل محفظه شیشه‌ای[3] درون اطاق تلقیح اشاره نمود.

چنانچه علیرغم تلاش فراوان در جهت استریل نمودن محیط آلودگی باز هم در محیط باقی بماند در آن صورت می‌توان از راه‌کارهای ذیل استفاده نمود.

1. بخوردادن روغن استریل‌کننده مانند تری‌اتیلن گلایکول با‌گرم‌کن‌فتیله‌ای در‌فضای اطاق که ابری از قطرات بسیار ریز و نسبتاً سنگین در هوا ایجاد شده که ضمن پائین آمدن ذرات آلاینده معلق در هوا را جذب کرده و از بین می‌برند. ذرات این روغن نسبتاً ریز و فرار بوده و هیچ گونه لایه قابل مشاهده‌ای در فضا ایجاد نمی‌نماید. این روش ارزان و آسان می‌باشد.

2. احداث نوعی محفظه شیشه‌ای کاملاً مسدود و نیمه استریل برای نقل و انتقال و کارهای کشت بافت که می‌توان آنها را از چوب و پنجره‌ای کوچک برای نگاه کردن درون آن ساخت که در یک طرف آن دو سوراخ لاستیکی مخصوص تعبیه می‌نمایند تا هنگام کار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه کرده و در صورت عدم استفاده، ورودی سوراخ‌ها با لفافه‌ای پوشیده می‌شود. مزیت عمده این محفظه ارزان، بودن استریل کردن آسان محیط داخل آن و عدم جریان مستقیم هوا به درون آن در ضمن کار می‌باشد.

3. استفاده از صافی‌های بسیار ریز که قطر چشمه‌های آن 3/0-1/0 میکرون بوده و از قطر هاگهای مضر بعضی قارچ‌ها و حتی از باکتری‌ها نیز کوچکتر است. از این صافی‌ها در سامانه‌های مخصوصی بنام هود تهویه ملایم استفاده می‌نمایند. در برخی از آزمایشگاه‌های پیشرفته تمام استریل، درون دیوارها یا سقف نیز از این نوع صافی‌ها استفاده شده و هوای ورودی اطاق با عبور از میان آنها تصفیه می‌شود.

برای کسب اطلاعات بیشتر به ضمیمه چهارم مراجعه شود

آلودگی، ممکن است در یک محل کم و در جای دیگر زیاد باشد و یا در یک مرحله از پرورش طغیان نماید یا این که علی‌رغم چند سال فعالیت، اثری از آن دیده نشود. از طرفی باید توجه داشت که نوع آلودگی، در مراحل و مکان‌های مختلف یکسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به یک سری عوامل مختلف داخلی یا محیطی متفاوت است که با اعمال یک سری تمهیدات و اصول بهداشتی تا حدی می‌توان آن را کنترل نمود.

شکل 19- دستگاه تصفیه‌کننده هوا برای کاهش                  شکل 20- هود تهویه ملایم هوا

میزان هاگ آلاینده درون آزمایشگاه                         

آماده کردن محیط کشت

پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می‌رسد. آگار، محصولی است که از نوعی جلبک دریایی بدست آمده و برای سفت کردن محیط کشت بکار می‌رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچ‌های خوراکی باشد، فرمول‌های متعددی وجود دارد که از این میان می‌توان به فرمول‌های استاندارد PDA  [4]وMEA   [5]همراه با مکمل خمیرمایه[6] اشاره نمود. در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط‌های کشت آگار حاوی پپتن[7] و نئوپپتن[8] (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است. محیط کشتی که مؤلفان توصیه می‌نمایند، مخلوطی از دانه‌های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می‌توان به محیط کشت زایلوز و 1- آرابینوز (از قندهای پنج کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می‌توان کلسیم، بیوتین، تیامین[9]، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد.

آنچه در ادامه‌ می‌بینید سه نوع فرمول مغذی آگار است که هر کدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراکی همچون دکمه‌ای، صدفی، شی‌تاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می‌شود که از بین آنها؛ 2 محیط PDY[10]  و MPG[11] مورد توجه مؤلفان این کتاب می‌باشند. توصیه می‌شود برای افزایش رشد میسلیوم‌ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول‌های زیر ترکیبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و درنهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یک لیتر برسانید.

Bunsen burner .[1]

inoculating .[2]

glove box .[3]

P.D.A= Potato Dextrose agar .[4]

MEA= Malt Extract Agar .[5]

yeast .[6]

(نوعی ماده آلیومینی سهل الهضم)  Peptone  .[7]

Neopeptone .[8]

ویتامین ب کمپلکس  Thiamine  .[9]

مخفف  Potato Dextrose Yeast .[10]

مخفف  Malt Peptone Grain .[11]